|
|
Identification of changes in membrane properties of astrocytes in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis
Vaňátko, Ondřej ; Turečková, Jana (vedoucí práce) ; Vlachová, Viktorie (oponent)
Amyotrofická laterální skleróza (ALS) je progresivní neurodegenerativní onemocnění nervové soustavy. Toto onemocnění je charakteristické ztrátou motorických neuronů a odumíráním kosterního svalstva. Astrocyty hrají roli v regulaci nástupu a progresi onemocnění díky jejich asociaci s neurony. Jednou z klíčových funkcí astrocytů je regulace iontové homeostázy. Deregulace tohoto procesu je spojená s řadou neurologických onemocnění. Cílem této práce bylo prozkoumat rozdíly v membránových vlastnostech astrocytů v ALS. Za tímto účelem jsme vygenerovali dvojitě-transgenní myší model s fenotypem podobným průběhu ALS a specifickou expresí zeleného fluorescenčního proteinu v astrocytech. K charakterizaci fenotypu toho modelu jsme použili dva sensorimotorické testy: wire grid hang test a rotarod test. Pomocí imunohistochemických metod jsme dále charakterizovali tento model na buněčné úrovni a prozkoumali expresi konkrétního iontového kanálu. Elektrofyziologické vlastnosti astrocytů jsme charakterizovali pomocí metody terčíkového zámku. Námi vygenerovaný dvojitě-transgenní model má charakteristický ALS fenotyp na úrovni celého organismu a je srovnatelný s původním ALS modelem, nicméně s rozdíly v nástupu a průběhu onemocnění. Tento model má charakteristický ALS fenotyp také na buněčné úrovni, kde dochází ke...
|
|
| |
|
|
Interakce glutamátových receptorů kainátového typu se steroidními látkami
Fraňková, Denisa ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Adámek, Pavel (oponent)
Kainátové receptory patří do rodiny glutamátových receptorů, mezi které se řadí také NMDA, AMPA a δ receptory. Glutamátové receptory se hojně vyskytují v mozku, a proto se velmi dynamicky zkoumají a to především z hlediska farmakologie, neboť se vkládá velký potenciál do hledání nových a úzce specifických modulátorů, které by se mohly využít v léčbě neurodegenerativních onemocnění. Cílem této práce bylo rozšířit poznatky o vlivu neurosteroidů na homomerní kainátové receptory (GluK1, GluK2, GluK3), u kterých je zkoumání modulace prostřednictvím neurosteroidů teprve v začátcích. Interakci homomerních kainátových receptorů s vybranými neurosteroidy (pregnenolon sulfát, pregnanolon sulfát, dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteron sulfát) jsme zkoumali pomocí metody terčíkového zámku v konfiguraci měření proudů z celé buňky a také pomocí mikrospektrofluorimetrické metody. Zjistili jsme, že největší modulační efekt na homomerní kainátové receptory způsobuje pregnenolon sulfát, který inhibuje odpověď těchto receptorů na agonistu glutamát. Klíčová slova kainátový receptor, glutamát, neurosteroidy, steroidy, metoda terčíkového zámku
|
|
|
Studium působení neurosteroidů na NMDA podtyp glutamátových receptorů.
Krausová, Barbora ; Vyklický, Ladislav (vedoucí práce) ; Bendová, Zdeňka (oponent)
N-methyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou ionotropní glutamátové receptory zapojené v excitačním synaptickém přenosu, synaptické plasticitě a excitotoxicitě. Jsou to heteromerní komplexy tvořené GluN1 spolu s GluN2A-D a/nebo GluN3A-B podjednotkami, které jsou aktivovány glutamátem a glycinem. Mnoho alosterických modulátorů může ovlivnit aktivitu těchto receptorů, včetně neurosteroidů. Pregnanolon sulfát (3α5βS) je endogenní neurosteroid, který inhibuje NMDA receptory use-dependentním způsobem a má neuroprotektivní účinek. Vazebné místo pro 3α5βS na molekule NMDA receptoru není dosud známé. Cílem mé práce bylo kinetickou analýzou rychlosti návratu odpovědi po inhibici 3α5βS přispět k poznání vazebného místa, kde steroid působí a dále pomocí bodových mutací určit aminokyselinové zbytky, které by se mohly podílet na vazbě neurosteroidu. Pro studium účinku 3α5βS na NMDA receptory jsme prováděli elektrofyziologická měření na lidských embryonálních ledvinných 293T buňkách exprimujících rekombinantní GluN1/GluN2B receptory. Prokázali jsme napěťovou nezávislost inhibičního účinku 3α5βS na GluN1/GluN2B receptory. Z výsledků mé práce vyplývá, že steroidy mohou dosáhnout vazebného místa na NMDA receptoru spíše prostřednictvím membrány, nežli přímo z vodného prostředí. Podařilo se nám určit aminokyselinový zbytek...
|
|
|
Volume-regulated anion channels in astrocytes- in vitro and in situ analysis
Harantová, Lenka ; Anděrová, Miroslava (vedoucí práce) ; Vargová, Lýdia (oponent)
Astrocyty musí být schopné udržet si stálý objem navzdory měnící se osmolaritě vnějšího či vnitřního prostředí, aby mohly správně fungovat. V hypotonickém prostředí nasávají vodu a zvětšují svůj objem. Ke snížení objemu na původní hodnotu pak u astrocytů slouží vypouštění intracelulárních anorganických a organických osmoticky aktivních částic, jako jsou například anorganické ionty, excitační aminokyseliny nebo polyoly, což vede k výtoku vody z buňky. Tento proces nazývaný regulační snižování objemu je zajišťován různými iontovými kanály a přenašeči. Relativně nedávno se do centra pozornosti dostaly objemově regulované aniontové kanály (VRAC). VRAC se vyznačují mírnou vnější usměrněností, střední vodivostí, propustností pro anorganické anionty a organické osmolyty a citlivostí k širokospektrým blokátorům aniontových kanálů. Naším cílem bylo pomocí metody terčíkového zámku charakterizovat VRAC v astrocytárních kulturách z neonatálních potkanů Wistar a objasnit, jaký vliv má intracelullární Na+ na aktivitu těchto kanálů. Dále jsme se zabývali charalterizací VRAC in situ v mozkových řezech 10 - 12 denních potkanů a to především v astrocytech v hipokampu. Zvyšování buněčného objemu jsme dosáhli aplikací hypotonického roztoku (250 mOsm). Ukázali jsme, že v souladu s dříve publikovanými daty, astrocytární kultury...
|
|
|
Příprava neuroaktivních steroidů pro studium NMDA receptorů
Vidrna, Lukáš ; Hodek, Petr (vedoucí práce) ; Pouzar, Vladimir (oponent)
Neurosteroidy jsou významnou skupinou látek ovlivňujících vzájemnou komunikaci nervových buněk. Podstatou jejich působení je rychlá alosterická modulace membránových receptorů pro přenašeče nervového signálu. Jedním z nejdůležitějších systémů ovlivňovaných neurosteroidy je NMDA receptor. Vazebné místo pro inhibiční steroidy na něm nebylo dosud nalezeno. Předkládaná práce je zaměřena na přípravu fluorescenčně značené fotoafinitní sondy, která může pomoci objasnit strukturu a umístění vazebného místa, a tím usnadnit nalezení účinných neuroprotektiv. Byl připraven (20S)-20-Aido-5β-pregnan-3α-yl N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole- 4-yl)-L-glutamyl 1-ester (8), jehož základní struktura napodobuje endogenní neurosteroid, dále obsahuje fotolabilní azidoskupinu a kovalentně vázanou fluorescenční NBD část. Kromě zmíněného pregnanového derivátu byla syntetizována i další fotoafinitní sonda s modifikovaným steroidním skeletem - pyridinium 17aα-azido-17α-methyl-17a-homo-5β- androstan-3α-yl 3-sulfát (29). Na buňkách z linie HEK293 exprimující NMDA receptory o podjednotkovém složení NR1-1a/NR2B bylo metodou terčíkového zámku ověřeno, že oba připravené deriváty si zachovaly schopnost endogenního neurosteroidu inhibovat aktivovaný NMDA receptor. V experimentálním systému buněčné linie HEK293 byly stanoveny hodnoty...
|
host ::
RSS.